Details

Данная работа посвящена характеристике рекомбинантной α-амилазы, в частности поиску оптимальных параметров культивирования дрожжей – по составу среды и времени роста, по изучению свойств рекомбинантной альфа-амилазы в том числе оптимальных значений pH и температуры фермента. При написании литературного обзора использовались следующие базы данных: eLIBRARY.RU и Google Scholar. Cтатистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием пакета программ: Microsoft word, Microsoft Excel и Origin. В рамках исследования решались следующие задачи: 1. Выбор объекта исследования: α-амилаза, производимая мутантным штаммом дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). 2. Поиск оптимальных параметров культивирование клеток  штамма  дрожжей S. cerevisiae. 3. Очистка фермента α-амилазы. 4. Измерение удельной активности α-амилазы. 5. Определение биохимических параметров α-амилазы. Данная работа была выполнена на базе Лабораторий биотехнологии ОМРБ НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ. В результате исследования было установлено, что оптимальным источником углерода в питательной среде для культивирования штамма дрожжей S. cerevisiae является глицерин, оптимальное время культивирования – 3 сут. Показано, что температурная стабильность наступала в промежутке от 40 ⁰C до 55 ⁰C, а оптимум достигался при 55 ⁰C. Для определения оптимального уровня pH использовали буферные растворы в диапазоне от 2,6 до 7,6. Установлено, что в диапазоне pH от 6 до 7,6 фермент являлся стабильным. При этом максимальная активность амилазы наблюдалась при pH 5,5.

The subject of the graduate qualification work: "Preparation and characterization of recombinant alpha-amylase from the culture of Bacillus sp. expressed by the yeast S. cerevisiae". This work is devoted to the characterization of recombinant alpha-amylase, in particular, the search for optimal parameters of yeast cultivation – according to the composition of the medium and growth time, to study the properties of recombinant alpha-amylase, including optimal pH and temperature values of the enzyme. When writing the literary review, the following databases were used: eLibrary.RU and Scopus. Statistical processing of experimental data was carried out using a software package: Microsoft word, Microsoft Excel and Origin. As part of the study, the following tasks were solved: 1. Selection of the research object: α-amylase produced by a mutant strain of yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). 2. Search for optimal parameters for cell culture of the yeast strain S. cerevisiae. 3. Purification of the α-amylase enzyme. 4. Measurement of specific activity of α-amylase. 5. Determination of the biochemical parameters of α-amylase. This work was performed on the basis of the Laboratories of Biotechnology of the Kurchatov Institute Research Center-PNPI. As a result of the study, it was found that glycerin is the optimal carbon source in the nutrient medium for cultivating the S. cerevisiae yeast strain, and the optimal cultivation time is 3 days. It is shown that temperature stability occurred in the range from 40 ⁰C to 55 ⁰C, and the optimum was reached at 55 ⁰C. Buffer solutions in the range from 2.6 to 7.6 were used to determine the optimal pH level. It was found that the enzyme was stable in the pH range from 6 to 7.6. At the same time, the maximum activity of amylase was observed at pH 5.5.

• ВВЕДЕНИЕ
• 1.1. Рекомбинантные белки
• 1.2. Системы экспрессии гетерологичных белков
• 1.3. Saccharomyces cerevisiae
• 1.3.1. Характеристика дрожжей рода Saccharomyces
• 1.3.2. Saccharomyces cerevisiae как система синтеза гетерологичных белков
• 1.4. Ферменты
• 1.4.1. α-амилаза. Структурная и субстратная специфичность
• 1.4.2. Физико-химические свойства α-амилазы
• 1.4.3. Методы получения, очистки и измерения активности α-амилазы
• 1.4.4. Продуценты α-амилазы
• 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
• 2.1. Объект исследования
• 2.2. Методы исследования
• 2.2.1 Составы питательных сред и условия культивирования
• 2.2.5. Метод измерения количества высвобожденных сахаров (PAHBAH)
  • 2.2.6. Метод определения амилолитической активности ферментных препаратов-источников альфа-амилазы
• 2.2.7. Влияние pH и температуры на активность фермента альфа-амилазы
• 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
• 3.1. Подбор оптимальных параметров культивирования по составу среды и времени роста
• 3.2. Измерение амилолитической активности
• 3.3. Биохимические параметры фермента
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ